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土壤堿性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
更新時(shí)間:2020-06-29 點(diǎn)擊量:2421

土壤堿性磷酸酶(S-AKP/ALP)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

測(cè)定意義:                           

土壤磷酸酶是一類(lèi)催化土壤有機(jī)磷化合物礦化的酶,其活性的高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解轉(zhuǎn)化及其生物有效性,是評(píng)價(jià)土壤磷素生物轉(zhuǎn)化方向與強(qiáng)度的指標(biāo)。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH顯著影響。通常按照其適pH范圍,分為堿性、中性和酸性三種類(lèi)型磷酸酶。

測(cè)定原理:

堿性環(huán)境中,S-AKP/ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉,通過(guò)測(cè)定酚的生成量即可計(jì)算出S-AKP/ALP活性。

自備儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、37℃恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水、無(wú)水乙醇和甲苯。

試劑組成和配制:

試劑一:液體×1瓶,4℃避光保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑三:液體×1瓶,4℃保存。

試劑四:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加576μL無(wú)水乙醇(自備),24μL蒸餾水充分溶解。(變褐色后不能再使用)

標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1瓶,0.5μmol/mL苯酚標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存。

催化反應(yīng):

稱(chēng)取風(fēng)干混勻土壤約0.1g,加入0.05mL甲苯(自備),輕搖15min;加0.4 mL試劑一并且搖勻后,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,開(kāi)始計(jì)時(shí),催化反應(yīng)24h;到時(shí)后迅速加入1mL試劑二充分混勻,以終止酶催化的反應(yīng)。10000rpm室溫離心10min,取上清液置于冰上待測(cè)。

顯色反應(yīng):

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到660nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL蒸餾水,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后室溫靜置30 min,于660 nm測(cè)定吸光度,記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL標(biāo)準(zhǔn)液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后室溫靜置30 min,于660 nm測(cè)定吸光度,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管:微量玻璃比色皿/酶標(biāo)板,加入10μL上清液,20μL試劑三,4μL試劑四,充分混勻,顯色后再加蒸餾水166μL,混勻后室溫靜置30 min,于660 nm測(cè)定吸光度,記為A測(cè)定管。

 

 

 

S-ALP活性計(jì)算:

活性單位定義:37℃中每克土壤每天釋放1μmol酚。

S-AKP/ALP(U/g土樣)=[C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)]×V總÷W÷T

                        = 0.725×(A測(cè)定-A空白)÷(A標(biāo)準(zhǔn)-A空白)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/L;V總:催化體系總體積,1.45mL;W:土壤樣品質(zhì)量,g;T:催化反應(yīng)時(shí)間,24 h=1 d。

 

 

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